| Einführung |
Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen (C-H) sind zwar in organischen Molekülen weit verbreitet, aber in der Regel nicht reaktiv und stellen eine Herausforderung für die chemische Manipulation dar. Jüngste Fortschritte in der C-H-Funktionalisierungstechnologie verändern diese Sichtweise und unterstreichen den kritischen Bedarf an der selektiven Installation von sp3-Kohlenstoff-Alkylgruppen in Kohlenwasserstoffgerüsten. In dieser Studie werden die ersten Katalysatoren auf Eisenbasis vorgestellt, die eine enantio-, regio- und chemoselektive intermolekulare Alkylierung von sp3-C-H-Bindungen durch C-H-Insertion von Carbenen ermöglichen.
Diese Katalysatoren, die von einem Cytochrom-P450-Enzym abgeleitet sind (genauer gesagt von einer "Cytochrom-P411"-Variante mit einer axialen Ligandensubstitution von Cystein zu Serin), sind vollständig genetisch kodiert und werden in Bakterien produziert. Durch gezielte Evolution lassen sich ihre Aktivität und Selektivität präzise modulieren. Die Verwendung von Eisen, dem am häufigsten vorkommenden Übergangsmetall, in dieser anspruchsvollen Chemie stellt eine wertvolle Alternative zu Edelmetallkatalysatoren dar, die traditionell den Bereich der C-H-Funktionalisierung beherrschen. Die im Labor weiterentwickelten Enzyme funktionalisieren effektiv eine Reihe von Substraten mit Benzyl-, Allyl- oder α-Amino-C-H-Bindungen, wobei sie einen hohen Umsatz und eine außergewöhnliche Selektivität aufweisen. Darüber hinaus erleichtern diese hocheffizienten Enzyme die Schaffung rationalisierter Synthesewege zu verschiedenen Naturprodukten. Der Nachweis, dass diese Enzyme die sp3-C-H-Alkylierung unter Verwendung ihres intrinsischen Eisen-Häm-Cofaktors vermitteln, erweitert den Nutzen der Vielfalt natürlicher Häm-Proteine für diese abiologische Umwandlung und fördert die Entwicklung neuartiger enzymatischer C-H-Funktionalisierungsreaktionen in der Chemie und synthetischen Biologie.
Biologische Systeme nutzen eine begrenzte Anzahl chemischer Strategien für die Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (C-C) beim Aufbau organischer Moleküle. Während viele Methoden auf der Manipulation funktioneller Gruppen beruhen, können bestimmte Enzyme, wie z. B. die Mitglieder der Familie der radikalen S-Adenosylmethionine (SAM), eine sp3-C-H-Bindungsalkylierung durchführen. Dieser Ansatz hat sich als äußerst vielseitig für die strukturelle Diversifizierung erwiesen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Biosynthese verschiedener Naturstoffe und Cofaktoren. Die bestehenden biologischen Mechanismen für diese Umwandlung beschränken sich jedoch auf Enzyme, die eine Methylgruppe übertragen oder ein aktiviertes Radikalakzeptorsubstrat an spezifische Moleküle konjugieren, wobei die Methylierung eine gängige Methode für die Installation von sp3-C-Alkyl durch radikale SAM-Enzyme ist.
Ziel dieser Forschungsarbeit war es, eine neue enzymatische Strategie für die Alkylierung von sp3-C-H-Bindungen zu entwickeln, die sich an dem in der Biologie weit verbreiteten C-H-Funktionalisierungsprozess der C-H-Oxygenierung orientiert. Cytochrom-P450-Enzyme erreichen die C-H-Oxygenierung mit Hilfe eines Häm-Cofaktors, der molekularen Sauerstoff aktiviert, um ein energiereiches Eisen-Oxo-Zwischenprodukt zu erzeugen, das sich selektiv in eine Substrat-C-H-Bindung einfügen kann. Analog dazu wurde angenommen, dass die Kombination eines Häm-Proteins mit einer Diazoverbindung eine im Protein eingeschlossene Eisen-Carben-Spezies erzeugt, die dann eine selektive C-H-Insertionsreaktion mit einem zweiten Substrat eingehen kann. Während Häm-Proteine nachweislich Carben-Transfer-Prozesse wie Cyclopropanierung und Heteroatom-Wasserstoff-Bindungs-Insertionen durchführen können, blieb ihre sp3-C-H-Bindungsfunktionalisierung eine Herausforderung. Für die sp3-C-H-Insertion von Metall-Carbenen in kleinen Molekülen, insbesondere für intermolekulare und stereoselektive Varianten, werden in der Regel Übergangsmetallkomplexe von Rhodium, Iridium und anderen verwendet. Künstliche Metalloproteine für die Carben-C-H-Insertion wurden durch den Einbau von Iridium-Porphyrin in Apo-Häm-Proteinvarianten entwickelt. Diese eisenkatalysierten Reaktionen erfordern häufig höhere Temperaturen, sind stöchiometrisch oder auf intramolekulare Prozesse beschränkt, was auf eine hohe Aktivierungsenergiebarriere für die C-H-Insertion mit einem Eisen-Carben hinweist. Da jedoch das Proteingerüst eines Enzyms die Reaktionsgeschwindigkeiten erheblich steigern und sogar einem ansonsten unreaktiven Kofaktor Aktivität verleihen kann, wurde erwartet, dass die gerichtete Evolution ein Häm-Protein so umgestalten könnte, dass es die Barriere für die Eisen-Carben-C-H-Insertionsreaktion überwindet und diese neue Funktion erhält.
Erste Untersuchungen umfassten das Screening einer Gruppe von achtundsiebzig Häm-Proteinen, darunter Varianten von Cytochromen P450, Cytochromen c und Globin-Homologen. Diese Häm-Proteine wurden in ganzen Escherichia coli-Zellen mit p-Methoxybenzylmethylether (1a) und Ethyldiazoacetat (2) bei Raumtemperatur unter anaeroben Bedingungen zur Reaktion gebracht. Die Reaktionen wurden anschließend auf die Bildung des C-H-Alkylierungsprodukts 3a untersucht. Häm-Proteine aus zwei Überfamilien wiesen geringe Mengen dieser promiskuitiven Aktivität auf, was die Machbarkeit der Schaffung von C-H-Alkylierungsenzymen mit unterschiedlichen Proteinarchitekturen belegt. Eine konstruierte Variante des Cytochroms P450BM3 aus Bacillus megaterium mit einer axialen Cystein-zu-Serin-Mutation (Cytochrom "P411"), P-4 A82L, lieferte 3a mit 13 Gesamtumsätzen (TTN). Außerdem katalysierte die Stickoxid-Dioxygenase aus Rhodothermus marinus mit der Y32G-Mutation (Rma NOD Y32G) die Reaktion mit 7 TTN. Ein zweites Alkansubstrat, 4-Ethylanisol (1i), wurde ebenfalls von diesen naszierenden C-H-Alkylierungsenzymen verarbeitet, wenn auch mit niedrigeren Umsatzzahlen. Der Häm-Kofaktor allein (Eisenprotoporphyrin IX) oder in Gegenwart von Rinderserumalbumin zeigte keine Aktivität.
Unter Verwendung von P411 P-4 A82L als Ausgangstemplate wurden aufeinanderfolgende Runden von Mutagenese und Screening in ganzen E. coli-Zellen durchgeführt, um Biokatalysatoren mit erhöhter Aktivität und Enantioselektivität für die C-H-Alkylierung zu identifizieren. Zu den für die Mutagenese ausgewählten Aminosäureresten gehörten diejenigen, die die Tasche des aktiven Zentrums auskleiden, sich in Schleifen und anderen flexiblen Proteinbereichen befinden oder eine nukleophile Seitenkette besitzen. Die verbesserten Varianten wurden dann in Reaktionen mit geklärtem E. coli-Lysat mit p-Methoxybenzylmethylether (1a) und 4-Ethylanisol (1i) bewertet. Fünf Runden Mutagenese und Screening führten zur Variante P411-gen6, die das Produkt 3a mit 60 TTN lieferte. Anders als bei der nativen Monooxygenase-Aktivität werden für den C-H-Alkylierungsprozess keine reduzierenden Äquivalente aus den FAD- und FMN-Domänen des Enzyms benötigt. In der Annahme, dass diese Domänen für die C-H-Alkylierung entbehrlich sein könnten, wurden systematische Verkürzungen von P411-gen6 durchgeführt, um die minimale(n) Domäne(n) zu ermitteln, die für die katalytische Aktivität erforderlich sind. Interessanterweise führte das Entfernen der FAD-Domäne, die 37 % der Aminosäuren des Proteins in voller Länge ausmacht, zu einem Enzym mit höherer C-H-Alkylierungsaktivität: P411ΔFAD-gen6 produzierte 3a mit 100 TTN, was einer 1,7-fachen Steigerung im Vergleich zu P411-gen6 entspricht. Dies deutet darauf hin, dass die FAD-Domäne negative allosterische Effekte auf die C-H-Alkylierungsaktivität ausüben könnte. Weitere Untersuchungen mit diesen verkürzten Enzymen bestätigten ihre Verwendbarkeit in ganzen E. coli-Zellen, geklärtem E. coli-Zell-Lysat und als gereinigte Proteine.
Acht zusätzliche Mutagenese- und Screening-Runden führten zu P411-CHF (P411ΔFAD C-H Funktionalisierungsenzym). P411-CHF weist eine 140-fache Verbesserung der Aktivität gegenüber P-4 A82L auf und liefert 3a mit ausgezeichneter Stereoselektivität (2020 TTN, 96,7:3,3 e.r. unter Verwendung von geklärtem E. coli-Lysat). Nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass die Stereoselektivität weiter verbessert werden kann, indem die Reaktion bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 4 °C) durchgeführt wird, ohne dass sich die TTN wesentlich verändert. Die enzymatische C-H-Alkylierung kann im Millimol-Maßstab durchgeführt werden: Mit 1,0 mmol Substrat 1a lieferte E. coli mit P411-CHF bei 4 °C 3a in 82 % isolierter Ausbeute, 1060 TTN und 98,0:2,0 e.r.
Vorläufige mechanistische Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Art des C-H-Einfügungsschritts zu verstehen. Unabhängige Anfangsraten für Reaktionen mit Substrat 1a oder deuteriertem Substrat 1a-d2 ergaben einen normalen kinetischen Isotopeneffekt (KIE) von 5,1 für die durch P411-CHF katalysierte C-H-Alkylierung, was darauf hindeutet, dass die C-H-Insertion geschwindigkeitsbestimmend ist. Unter Verwendung von E. coli, das P411-CHF enthält, wurde eine Vielzahl von Benzylsubstraten für die Kopplung mit Ethyldiazoacetat untersucht. Sowohl elektronenreiche als auch elektronenarme Funktionalitäten am aromatischen Ring wurden gut toleriert, und auch zyklische Substrate dienten als geeignete Kupplungspartner. Alkylbenzole wurden erfolgreich an sekundären benzylischen sp3-C-H-Bindungen funktionalisiert. Bei der Biotransformation des Substrats 1l, das sowohl tertiäre als auch sekundäre benzylische C-H-Bindungen aufweist, funktionalisierte P411-CHF trotz der höheren Dissoziationsenergie der C-H-Bindung (BDE) vorzugsweise die sekundäre Position. Das aus Ethyldiazoacetat erzeugte Carben-Zwischenprodukt gehört zur Klasse der reinen Akzeptoren. Im Gegensatz zu den häufiger verwendeten Donor/Akzeptor-Carbenen sind die Akzeptor-Only-Zwischenprodukte elektrophiler, was selektive Reaktionen mit dieser Carbenklasse zu einer großen Herausforderung für niedermolekulare Katalysatoren macht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass P411-CHF dieses hochreaktive Zwischenprodukt in den Griff bekommen kann, um die gewünschten sp3-C-H-Alkylierungsprodukte mit hoher Enantioselektivität zu liefern.
Enzyme können eine außergewöhnliche Reaktionsselektivität erreichen, da sie in der Lage sind, während eines Reaktionszyklus mehrere Wechselwirkungen mit Substraten und Zwischenprodukten zu bilden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Proteingerüst modifiziert werden könnte, um komplementäre Enzyme zu erzeugen, die für ein bestimmtes Substrat unterschiedliche Reaktionsergebnisse erzielen. Als P411-CHF mit 4-Allylanisol (1m) konfrontiert wurde, einem Substrat, das sowohl zur C-H-Alkylierung als auch zur Cyclopropanierung fähig ist, wurde beobachtet, dass das C-H-Alkylierungsprodukt 3m mit einer Selektivität von mehr als 25:1 dominierte. Im Gegensatz dazu katalysierte eine verwandte P411-Variante in voller Länge, P-I263F, die im Vergleich zu P411-CHF dreizehn Mutationen in der Häm-Domäne enthält, ausschließlich die Bildung des Cyclopropanprodukts 3m''. Darüber hinaus erzeugte P411-CHF trotz der bekannten Reaktivität von Silanen mit Eisen-Carben das C-H-Alkylierungsprodukt 3h, wenn das Substrat 1h in der Reaktion verwendet wurde (obwohl das Si-CH-Insertionsprodukt 3h'' ebenfalls beobachtet wurde, wurde seine Bildung möglicherweise nicht von P411-CHF katalysiert). Umgekehrt ergab die Reaktion mit P-I263F nur das Si-CH-Insertionsprodukt. Diese Beispiele verdeutlichen eine bemerkenswerte Eigenschaft makromolekularer Enzyme: Durch einfache Änderung der Aminosäuresequenz des Proteinkatalysators können unterschiedliche Produkte erhalten werden.
Die enzymatische C-H-Alkylierung geht über die Funktionalisierung von benzylischen C-H-Bindungen hinaus. Strukturell unterschiedliche Moleküle mit allylischen oder propargylischen C-H-Bindungen sind hervorragende Substrate für diese Chemie. Im Gegensatz zu den Verbindungen 1a-1m, die einen starren Benzolring aufweisen, verfügen die Verbindungen 4a-4c und 4e über flexible lineare Alkylketten. Ihre erfolgreiche enantioselektive Alkylierung deutet darauf hin, dass die aktive Stelle des Enzyms die Konformationsflexibilität des Substrats aufnehmen und gleichzeitig eine bevorzugte Ausrichtung des Substrats relativ zum Carben-Zwischenprodukt beibehalten kann. Zur Veranschaulichung der Nützlichkeit dieser Biotransformation wurde die Methodik auf die formale Synthese von Lyngbsäure angewandt. Marine Cyanobakterien bauen dieses vielseitige Biomolekül in die Malyngamid-Familie von Naturprodukten ein, und bei der Totalsynthese wird Lyngsäure häufig als strategisches Zwischenprodukt verwendet. Unter Verwendung von E. coli, das P411-CHF enthält, wurde das Zwischenprodukt 5a in einem Maßstab von 2,4 mmol in 86 % isolierter Ausbeute, 2810 TTN und 94,7:5,3 e.r. hergestellt. Durch anschließende Hydrierung und Hydrolyse wurde quantitativ (R)-(+)-6 erhalten, das durch decarboxylative Alkenylierung zu (R)-(+)-Lyngbsäure weiterverarbeitet werden kann.
Im Rahmen der Untersuchungen zum Substratumfang wurde P411-CHF auf Alkylaminverbindungen angewendet. Solche Verbindungen stellen typischerweise Schwierigkeiten für C-H-Funktionalisierungsmethoden dar, da die Aminfunktionalität an den Katalysator koordinieren und diesen hemmen oder zu unerwünschten Nebenreaktionen führen kann (z. B. Ylidbildung und damit verbundene Umlagerungen). Bei Substraten 7a oder 7b, die sowohl benzylische C-H-Bindungen als auch α-Amino-C-H-Bindungen enthalten, ergab P411-CHF das entsprechende α-Aminoesterprodukt mit hoher Effizienz. Bemerkenswert ist, dass die benzylische C-H-Insertion nicht beobachtet (bei 7a) oder deutlich reduziert (bei 7b) wurde, obwohl die Bindungsdissoziationsenergien (BDEs) von benzylischen C-H-Bindungen im Vergleich zu α-Amino-C-H-Bindungen im Allgemeinen niedriger sind. Darüber hinaus erwiesen sich die N-Arylpyrrolidine (7c-7e) als hervorragende Substrate, die selektiv an der α-Amino-Sp3-Position alkyliert werden. Mit P411-CHF übertraf die sp3-C-H-Alkylierung von 7c eine Friedel-Crafts-Reaktion am Arylring, ein Prozess, der häufig von anderen Carben-Transfer-Systemen bevorzugt wird. Darüber hinaus bietet das Alkylierungsprodukt 8d einen plausiblen Weg für die Synthese von β-Homoprolin, einem für die medizinische Chemie relevanten Strukturmotiv.
Da P411-CHF sowohl primäre als auch sekundäre α-Amino-C-H-Bindungen alkyliert, wurde die Selektivität des Enzyms für diese Positionen untersucht. Unter Verwendung von N-Methyltetrahydrochinolin 7f als Alkansubstrat lieferte P411-CHF α-Aminoesterprodukte mit 1050 TTN und einem Verhältnis von 9:1 der Regioisomere (C2:C1), mit 73,0:27,0 e.r. für 8f. Da der Tetrahydrochinolinring ein bevorzugtes strukturelles Motiv in Naturprodukten und bioaktiven Molekülen ist, könnte seine selektive Funktionalisierung eine prägnante Strategie für die Alkaloidsynthese darstellen. Um die Selektivität für die Alkylierung von 7f zu erhöhen, wurden Varianten entlang des evolutionären Pfades von P-4 A82L zu P411-CHF untersucht. P411-gen5 zeigte eine noch höhere Regioselektivität und lieferte das Produkt mit der umgekehrten Stereopräferenz. In einer Reaktion im Maßstab von 3,0 mmol lieferte E. coli, das P411-gen5 enthielt, 8f in 85 % Ausbeute mit ausgezeichneter Selektivität (1310 TTN, >50:1 r.r., 8,9:91,1 e.r.). In nur wenigen Schritten wurde das enzymatische Produkt erfolgreich in das Alkaloid (R)-(+)-Cusparein umgewandelt.
Schließlich wurde der Einbau von verschiedenen Alkylgruppen untersucht. Unter Verwendung verschiedener Diazo-Reagenzien kann die enzymatische C-H-Alkylierung ein Alkansubstrat, wie 7a, in mehrere Produkte diversifizieren. Die Bandbreite der Diazosubstrate geht über esterbasierte Reagenzien hinaus; es wurde beobachtet, dass die Weinreb-Amid-Diazoverbindung 9c und das Diazoketon 9d an der enzymatischen C-H-Alkylierung teilnehmen und die Produkte 10c bzw. 10d ergeben. Eine zusätzliche Substitution an der α-Position des Carbens wird jedoch im Allgemeinen von P411-CHF und den gängigen verwandten Enzymen nicht gut toleriert. Mit Ausnahme von 10b lieferten die Reaktionen mit disubstituierten Carbenreagenzien keine nennenswerten Mengen der gewünschten Produkte.
Diese Studie bestätigt, dass ein Cytochrom P450 die Fähigkeit erlangen kann, C-C-Bindungen aus sp3-C-H-Bindungen zu konstruieren, und dass sowohl die Aktivität als auch die Selektivität durch gerichtete Evolution erheblich verbessert werden können. Die Natur bietet eine Vielzahl potenzieller alternativer Ausgangspunkte, um den Reaktionsumfang weiter zu erweitern und andere Selektivitäten zu erreichen. Die Cytochrom-P450-Superfamilie kann eine immense Bandbreite organischer Moleküle für ihre native Oxygenierungschemie verarbeiten; es ist vorstellbar, dass von P411 abgeleitete Enzyme und die breitere Vielfalt natürlicher Häm-Proteine genutzt werden können, um Familien von C-H-Alkylierungsenzymen zu erzeugen, die den Umfang und die Selektivität wiedergeben, die für die C-H-Oxygenierungskatalysatoren der Natur charakteristisch sind. |
Produkte
Bars
Perlen & Kugeln
Bolzen & Muttern
Tiegel
Scheiben
Fasern & Stoffe
Filme
Flocke
Schaumstoffe
Folie
Granulat
Honigwaben
Tinte
Laminat
Klumpen
Maschen
Metallisierte Folie
Platte
Pulver
Stab
Blätter
Einkristalle
Sputtering Target
Rohre
Waschmaschine
Drähte
Umrechner & Rechner
Schreiben Sie für uns
